WB實(shí)驗(yàn)選擇普通膠or梯度膠？

蛋白質(zhì)免疫印跡法，即Western Blot，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色，通過(guò)分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因在蛋白水平的表達(dá)研究、抗體活性檢測(cè)和疾病早期診斷等多個(gè)方面。

     實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，是選擇一個(gè)濃度的膠來(lái)進(jìn)行樣本的分離，還是選擇梯度膠，普通膠和梯度膠兩者之間有怎樣的差別？

普通膠和梯度膠兩者的差別：

1 、首先，梯度凝膠比普通膠的分離范圍更寬，可以同時(shí)分離較大范圍分子量的蛋白質(zhì)。普通膠電泳對(duì)于分子量超過(guò)其分離范圍的蛋白質(zhì)，過(guò)大或過(guò)小，都不能分離。

2、而梯度凝膠孔徑范圍比普通膠大，分子量較大的蛋白質(zhì)可以在凝膠頂部大孔徑部分得到分離，而分子量較小的蛋白質(zhì)可以在凝膠底部小孔徑部分得到分離，所以分子量較大和較小的蛋白質(zhì)可以同時(shí)得到分離。

3、梯度凝膠可以分辨分子量相差較小，在普通膠中不能分辨的蛋白質(zhì)。電泳過(guò)程中，蛋白質(zhì)在梯度凝膠中遷移，經(jīng)過(guò)的孔徑越來(lái)越小，直到凝膠的孔徑不能通透。

4、電泳過(guò)程中蛋白質(zhì)被濃縮，集中在一個(gè)很窄的區(qū)帶中，而分子量略小的蛋白質(zhì)，可以遷移得更靠前一些，被集中在略前面的區(qū)帶中。由于梯度凝膠孔徑逐步變小，在蛋白質(zhì)不能通透的孔徑附近，對(duì)蛋白有濃縮作用。

5、電泳后形成很窄的區(qū)帶，可以分辨出分子量相差較小的蛋白質(zhì)。對(duì)于太稀的樣品，在電泳過(guò)程中可以將樣品分幾次加樣，大小不同的蛋白質(zhì)分子最終都會(huì)滯留在其相應(yīng)的凝膠孔徑中而得到分離。

6、可以直接測(cè)定天然狀態(tài)蛋白質(zhì)的分子量而不需要解離為亞基，因此這一方法可以與SDS-PAGE測(cè)定分子量的方法互為補(bǔ)充。

不同濃度普通膠和梯度膠的效果展示：

• 10%濃度的膠在20-100kDa的范圍分離比較均勻
• 15%濃度的膠在分離特別小分子的蛋白時(shí)，分的比較開(kāi)，但是大分子就很難分離開(kāi)
• 梯度膠在5-400kDa范圍，蛋白分布都比較均勻，且都分離比較明顯，所以如果有大小蛋白同時(shí)想分離在一塊膠時(shí)，梯度膠的效果就非常明顯了。