質粒提取竅門

       提取質粒DNA的方法有很多種，從提取產(chǎn)量上分可分為微量提取、中量提取、大量提取，從使用儀器上分可分為一般提取和試劑盒方法提取，從具體操作方法分可以分為堿裂解法、煮沸法等，各種不同的方法各有其優(yōu)缺點，根據(jù)不同的實驗目的可以采用合適的提取方法。

堿裂解法：

       使用堿與SDS裂解法從E. coli（大腸桿菌）中分離制備質粒DNA已有30多年的歷史。將細菌懸浮液暴露于高pH值的強陰離子洗滌劑中，會使細胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質變性，將質粒DNA釋放到上清中。堿性溶劑使堿基配對*破壞，閉環(huán)的質粒DNA雙鏈仍不會彼此分離，這因為它們在拓撲學上是相互纏繞的。只要OH-處理的強度和時間不要太過，當pH值恢復到中性時，DNA雙鏈就會再次形成。在裂解過程中，細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用K+取代Na+時，復合物會從溶液中有效地沉淀下來，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復性的質粒DNA。在SDS存在的條件下，堿水解是一項非常靈活的技術，它對E. coli的所有菌株都適用，并且其細菌培養(yǎng)物的體積可以從1-500mL以上。

       質粒小提試劑盒，它結合了優(yōu)化的堿裂解法，以及方便快捷的硅膜離心技術，具有高效，快捷的特點，能在30min內完成全部操作。利用試劑盒能從1-5mL過夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液中純化得到10-40μg高質量的質粒DNA（OD260/OD280=1.7-1.9），此質粒DNA可直接用于DNA序列分析，各種酶促反應，PCR以及部分細胞系的轉染等。

煮沸法：

        煮沸法是將細菌懸浮于含有Triton X-100和能消化細胞壁的溶菌酶的緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細菌外壁，還有助于解開DNA鏈的堿基配對，并使蛋白質和染色體DNA變性。但是。閉環(huán)質粒DNA鏈彼此不會分離，這是因為它們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓撲結構。當溫度下降后，閉環(huán)DNA的堿基又各就各位，形成超螺旋分子，離心除去變性的染色體DNA和蛋白質，就可從上清中回收質粒DNA。煮沸裂解法對于小于15kb的小質粒很有效，可用于提取少至lmL（小量制備），多至250mL（大量制備）菌液的質粒，并且對大多數(shù)的大腸桿菌菌株都適用。但對于那些經(jīng)變性劑、溶菌酶及加熱處理后能釋放大量碳水化合物的大腸桿菌菌株，則不推薦使用該法。這是因為碳水化合物很難除去，會抑制限制酶和聚合酶活性。若碳水化合物的量很大，在CsCl-溴化乙錠梯度離心中會使超螺旋質粒DNA帶變得模糊不清。大腸桿菌菌株HBl01及其衍生菌株（其中包括TGl）能產(chǎn)生大量的碳水化合物，不適于用煮沸法裂解。

抽提竅門及注意事項：

1、加裂解液后，操作一定要溫和，劇烈混合會導致基因組DNA污染。

2、洗脫時60℃溫育（Ellution Buffer）洗脫緩沖液或去離子水效果更好。

3、若質粒提取含量低，可增加菌液樣或換用ArtMedia Plasmid Culture，其比LB培養(yǎng)基質粒得量高。

4、菌體應*懸浮 ， 如果沒有*懸浮菌體，則殘留的菌體團塊在溶液 II 加入后，變成難以*裂解的團塊。這個團塊在溶液 III 加入后，會有一部分蛋白質繼續(xù)存在于溶液中，成為蛋白質殘留的最大根源。

5、加入溶液 II 后，混勻，體系最好能立即變得清澈。體系如果變得清澈了，馬上加入溶液 III 中和。

6、中和的操作 ，在 1.5ml 離心管中加入溶液 III 后，先顛倒兩次，使管底朝上，用指頭彈擊管底數(shù)次，再顛倒混勻。效果非常好。

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